     北京中医药大学基础医学院    陈明  (北京 100029)

    摘要：目的  探讨百福生胶囊对人胃癌细胞凋亡的作用；方法  在已传代的细胞悬液中加入将三不同浓度的百福生提取稀释液，并设对照组，以观察细胞凋亡情况；结果  百福生提取液三个剂量均能有效地抑制人胃癌细胞的增殖，以5×10^-3 mol组尤为明，凋亡指数为53.16%，抑制率为60.1%，与对照组相比，差异有显著意义(P<0.01)，细胞形态学观察：经百福生提取液处理后，细胞核染色体断裂、聚集、核碎裂、溶解，形成凋亡小体而被巨噬细胞吞噬；结论  百福生提取液通过干扰肿瘤细胞生长，代谢，增殖等过程，触发肿瘤细胞凋亡通路，导致细胞凋亡。
    百福生胶囊系一种天然药物提取而成的生物反应调节剂(Biological Response Modify——BMS)，临床主要功效为益气补虚，扶正增免，提高免疫功能。近年来的研究表明，百福生胶囊具有抗肿瘤作用，体内、体外抑瘤实验表明百福生提取液具有明显的抗肿瘤效应，并能延长荷瘤小鼠的生存期[1]，临床研究显示百福生胶囊能影响虚证患者的T细胞亚群[2]，并能够改善晚期恶性肿瘤患者的生存质量，延长其生存期[3]，为了进一步探讨百福生胶囊抗肿瘤治疗的作用机制，我们应用百福生提取液对人胃癌细胞的凋亡作用进行了实验研究，现报告如下：
    1、材料与方法
    1.1 实验材料
    实验药品：百福生提取液由郑州博生医药技术发展有限公司提供，浓度98.5%,实验前先用生理盐水将百福生提取液稀释制备，使其终浓度稀释成5×10^-3 mol/L、5×10^-4 mol/L、5×10^-5 mol/L 三种不同浓度的百福生提取稀释液,备用。
    实验试剂：小牛血清：上海生物制品研究所提供，56℃、30min灭活，-20℃冰箱保存。PRMI1640培养液：美国Gibco公司产。
    1.1.2  实验细胞株  人胃癌SGC-7901细胞系引自北京肿瘤研究所。
    1.1.3 实验仪器
    光学显微镜，重庆光学仪器厂，电子显微镜(JEN-100CX日本电子公司)，96孔培养板(丹麦Nunc公司)，FACS Vantage流式细胞仪(美国BECTON-DICKINSONW公司)。
    1.2  实验方法
    1.2.1 细胞培养：用含RPMI1640、10%小牛血清、100U/mL青霉素、100mg/ml链霉素的培养液，置37℃、5%CO2及饱和湿度的恒温箱中悬浮培养人胃癌SGC-7901细胞，每2-3天传代一次。在传代24h的细胞悬液中加入三种不同浓度的百福生提取稀释液（5×10—3 mol/L、5×10—4 mol/L、5×10—5 mol/L ），分别于加药后24h、48h、72h内收集细胞备测，以观察细胞凋亡情况。并设对照组。
    1.2.2 光学显微镜观察  用倒置显微镜观察细胞凋亡改变，收集细胞用离心涂片机涂片，10%中性福尔马林固定，常规HE染色。
    1.2.3 流式细胞仪：对照组与实验组细胞分别用2%胰酶-EDTA消化，1000r/min离心10min收集，用0.01mol/L pH7.4 PBS洗3次，4℃、70%乙醇固定，上机前加50μg/ml碘化丙锭(PI) 4℃染色1h，调整细胞浓度为105/ml，激发波长472nm，细胞数15000个，用流式细胞仪进行细胞周期分析，低于G1期DNA含量的细胞为凋亡细胞。
    1.2.4 凋亡指数(AI)：凋亡指数是随机计数100个细胞中凋亡形态细胞所占百分数。每张涂片在400倍高倍视野下，每视野计数100个细胞，随机选择5个视野(×40)，计数500个细胞，计算每个视野凋亡细胞所占百分数，求均值。
    2 结果
    2.1 百福生提取液对人胃癌SGC-7901细胞生长增殖的抑制作用
    不同浓度的百福生提取液均能明显抑制人胃癌SGC-7901细胞的增殖，由附表可见，细胞抑制率随药物的浓度升高而逐渐增强，具有一定的量效关系，百福生提取液5×10^-3mol/L、5×10^-4 mol/L、5×10^-5 mol/L三个不同剂量组的抑制率分别为37.2%、49.6%、60.1%，与对照组相比，差异有显著意义(P<0.01)。

    附表  百福生提取液对人胃癌细胞的凋亡作用及抑制作用
分  组凋亡指数(AI,%)            增殖抑制率
24h       48h       72h

对   照   组 2.06%      2.11%      1.98%    --
5×10^-5 mol组 10.76%*    15.51%*    19.32%* 37.2%**
5×10^-4 mol组 16.22%*    23.49%**   49.05%** 49.6%**
5×10^-3 mol组 17.10%**   36.25%**   53.16%** 60.1%**
注：实验组与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
    2.2 凋亡指数(AI)观察
    细胞凋亡指数计数结果表明：随百福生提取液浓度的增高凋亡指数也增加，以5×10—3 mol组尤为明显。附表可见，凋亡指数与药物浓度的对数呈正相关(P<0.05)。实验组浓度相同时，凋亡指数随处理时间延长而增加，高峰在72h，凋亡指数为53.16%。
    2.3 细胞形态学观察  培养的细胞经百福生提取液处理后，HE染色，在光学显微镜下观察表明：实验组经百福生提取液处理3h后，5×10^-5 mol组可见20%癌细胞呈圆形，贴壁细胞体积变小、细胞排列稍疏松，折光性差，染色质凝集、悬浮细胞16%，核分裂相减少，有凋亡小体形成。百福生提取液5×10^-4mol组43%癌细胞呈圆形、细胞排列较疏松，凋亡细胞染色质凝集并聚集在核膜周围、悬浮细胞47%，核分裂相少见。百福生提取液5×10^-3mol组83%癌细胞呈圆形、细胞排列明显疏松，胞浆内出现空泡、核碎裂、核溶解，呈典型的凋亡细胞形态学变化。观察中发现：随着药物浓度增加和处理时间延长，具有凋亡形态的细胞数目亦增加。而对照组细胞呈六边形，细胞核大而圆、核浆比例较大，核仁多，排列密集，折光性好，无悬浮细胞。
    3 讨论
    近年来国内外的一些研究证明许多因素可调控肿瘤细胞凋亡，如化疗药物，癌基因、细胞因子、某些中药等［4］。细胞凋亡已作为探讨和揭示肿瘤药物的作用机制和耐药性，筛选新的抗肿瘤药物的手段之一［5］。本实验选用百福生提取液作用于人胃癌SGC-7901细胞系，观察其对人胃癌细胞的凋亡作用。细胞形态学观察显示：经百福生提取液处理3h后，癌细胞呈圆形，贴壁细胞体积变小，细胞核染色体发生断裂、聚集、进而固缩核膜崩解，核碎裂、核溶解，细胞浆空泡变、形成凋亡小体而被巨噬细胞吞噬。实验初步证实了百福生提取液对人胃癌细胞的抑制作用，剂量越高，抑制作用越强，具有一定的量效关系，通过形态学观察和流式细胞仪检测，符合细胞凋亡，表明百福生提取液可通过干扰肿瘤细胞生长，代谢，增殖等过程，最终触发肿瘤细胞凋亡通路，导致细胞凋亡，因此，提示百福生提取液的抗瘤疗效之一是其有效成分通过干扰和阻滞肿瘤细胞的增殖，诱发肿瘤细胞凋亡而实现的，这种凋亡调控机制的建立，可从根本上解决永生的癌细胞的生长机制，以调控凋亡达到抑制肿瘤生长的目的。

参考文献
1、邵素霞等，百福生胶囊对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用研究，陕西肿瘤医学，2002,10(4):287-288
2、常林、程万里、林平等，百福生胶囊治疗慢性病虚证患者的临床研究，深圳中西医结合杂志，2002，12(6)
3、罗建平等，百福生胶囊对中晚期恶性肿瘤患者生存期的影响，深圳中西医结合杂志，2002，12(5)：278-288
4、Kerr FER Winterford CM,Biol ADA,et al,Apoptosis:its significance in cancer and cancer therapy,Cancer,1994,15:2013-2018.